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Analisi mutazionale nei GIST

Dr.ssa Sabrina Rossi (Dipartimento di Patologia, Ospedale Regionale di Treviso)


Sitges/Barcelona, Spagna 18 maggio 2016

La mia relazione si divide in due parti. Nella prima parte si descrivono i fattori che potrebbero invalidare l’analisi mutazionale nei GIST, mentre nella seconda parte si focalizza sul workflow che si applica ai casi di GIST in cui l’analisi mutazionale ha dato esito negativo.


Fattori che possono invalidare l’analisi mutazionale
 

Il successo o il fallimento dell’analisi mutazionale può dipendere dal metodo usato per eseguire l’analisi: fattori analitici. Esistono metodi diversi che hanno una diversa sensibilità. Nel metodo tradizionale (Sanger) la reazione di sequenziamento viene eseguita singolarmente e copre una regione di massimo 1000 nucleotidi. Nei metodi di nuova generazione (Next Generation Sequencing, NGS) in una singola reazione vengono sequenziati milioni di piccole sequenze in parallelo. La sensibilità analitica dell’NGS è di gran lunga maggiore e può identificare mutazioni rappresentate a bassa frequenza, 5%-10%. Poiché le mutazioni di KIT e PDGFRA sono di solito in eterozigosi, la frazione tumorale minima necessaria all’identificazione della mutazione è valutabile intorno al 10%-20% in NGS. Questo valore aumenta se l’analisi è effettuata col metodo Sanger (almeno 30%). Nell’Ospedale di Treviso il metodo usato oggi per l’analisi mutazionale in diagnostica è quello tradizionale, il meno sensibile dei due. Tuttavia, la sensibilità analitica è raramente un fattore critico nell’analisi mutazionale dei GIST. Infatti, nella stragrande maggioranza dei casi, l’analisi mutazionale è effettuata su campioni ottenuti da resezione di GIST non trattati, in cui la frazione tumorale è molto alta. Ci sono però delle eccezioni. La sensibilità analitica può essere critica nel caso di piccole biopsie con una bassa frazione tumorale e nel caso di metastasi in progressione durante il trattamento farmacologico con inibitori delle tirosinchinasi. In quest’ultimo caso, infatti, potrebbe essere utile identificare subcloni neoplastici rappresentati a bassa frequenza per modulare la terapia (mutazioni per esempio che causano resistenza all’Imatinib ma sono sensibili al Sunitinib o al Regorafenib) ed in questo contesto l’NGS o la ‘deep sequencing’ potrebbero fare la differenza.
Oltre che dai fattori analitici, il successo o il fallimento dell’analisi mutazionale può dipendere da fattori legati al campione tissutale su cui l’analisi viene eseguita: fattori pre-analitici.  Infatti, fondamentale per il successo del sequenziamento di KIT e PDGFRA è la qualità del DNA, che dipende dalla qualità del tessuto. Il tessuto può essere congelato o, come succede normalmente, fissato in formalina ed incluso in paraffina.
 Il DNA estratto dal tessuto congelato versus il tessuto paraffinato è di qualità più alta (non frammentato); dall’altra parte però il tessuto paraffinato consente di essere più accurati nell’identificazione della presenza delle cellule neoplastiche e nella valutazione della frazione tumorale nel campione. Fondamentale per il successo del sequenziamento genico è anche la quantità del DNA estratto che dipende a sua volta dalla quantità di cellule tumorali vitali, che può essere critica nel caso di piccole biopsie, e dalla frazione di cellule tumorali vitali, che può essere critica nel caso di resezione di GIST o metastasi di GIST in trattamento, per presenza di necrosi e sclerosi indotte dal trattamento, o nei rarissimi casi di rottura della pseudocapsula dei GIST, per la presenza di cellule infiammatorie, stravasi emorragici e fibrina. Il patologo valuta sempre la sezione colorata in ematossilina del campione e se necessario cerchia l’area neoplastica e stima la frazione tumorale. Il tecnico poi gratta con la lama del bisturi dalle sezioni non colorate l’area cerchiata da cui si estrae il DNA. L’identificazione delle cellule neoplastiche può essere aiutata da alcune colorazioni immunoistochimiche (CD117 e DOG1).
Per l’analisi mutazionale dei GIST primitivi usata in diagnostica, potrebbe essere ragionevole indagare prima le mutazioni più frequenti (KIT esone 9/11 e PDGFRA esone 18) e soltanto in caso di negatività, indagare le mutazioni meno frequenti (KIT esone 8/13/17 e PDGFRA esone 12/14). Essendo l’Ospedale di Treviso un centro di riferimento per l’analisi mutazionale dei GIST e ricevendo, come tale, spesso casi complessi (pluritrattati, resistenti al trattamento ecc.), tutti gli esoni possibilmente coinvolti di KIT e PDGFRA vengono di solito sequenziati simultaneamente.


Come si procede nel caso in cui il campione risulti negativo per le mutazioni di KIT e PDGFRA?

I GIST negativi per le mutazioni di KIT e PDGFRA, “GIST wildtype”, sono un gruppo eterogeneo, che rappresenta circa il 15% dei GIST ed è costituito da diversi sottogruppi. Al giorno d’oggi non è più sufficiente definire un GIST come wildtype, ma è opportuno cercare di caratterizzarlo più approfonditamente per capire a che sottogruppo appartiene.
Prima di tutto il patologo si domanda se il GIST wildtype possa essere “SDH-deficient”, cioè un GIST da difetto della succinatodeidrogenasi, che è un complesso enzimatico mitocondriale costituito da diverse subunità (A, B,C,D). Quando questo enzima non funziona si accumula il suo substrato (succinato) che è legato alla tumorigenesi tramite due meccanismi: l’inibizione della diossigenasi TET2 con conseguente inibizione della demetilazione del DNA e rimodellamento epigenetico, e l’attivazione di HIF1-alfa con aumento dell’angiogenesi. A livello genetico circa il 70% dei GIST “SDH-deficient” sono caratterizzati dalla mutazione di una delle subunità del complesso SDH, più frequentemente la A, che di solito è una mutazione germ-line/costitutiva, cioè presente sia nel sangue del paziente che nel tumore, e che nel tumore si associa in genere alla perdita dell’allele non mutato (loss of heterozigosy). Diversamente, in circa il 30% dei GIST “SDH-deficient”, non si identifica la mutazione, mentre si trova la metilazione del promotore del gene della subunità C di SDH. I GIST “SDH-deficient” differiscono dai GIST KIT/PDGFRA-mutati sia per caratteristiche cliniche, che patologiche. Infatti in questo sottogruppo è prevalente il sesso femminile, la giovane età, la sede gastrica, la multifocalità, l’insolito pattern di progressione con possibile coinvolgimento linfonodale o cutaneo/sottocutaneo, ed il decorso indolente (solo una minoritaria frazione metastatizza anche dopo lunghi intervalli dalla resezione della neoplasia primitiva ed, anche nello stadio metastatico, la sopravvivenza può essere molto lunga). Da un punto di vista istologico, i GIST “SDH-deficient” sono caratterizzati da un pattern di crescita multinodulare, e dalla perdita di espressione immunoistochimica della subunità B di SDH. Quindi, il patologo, una volta ottenuto un risultato negativo dall’analisi mutazionale di KIT/PDGFRA, può tornare sul caso, correlare il dato molecolare con i dati clinico-patologici e valutare l’espressione di SDH-B. I GIST “SDH-deficient” hanno in genere alte espressioni del recettore del insulin growth factor di tipo 1 (IGF1R), anche se non è chiaro come il difetto di SDH e l’iperespressione di IGF1R siano legati. Quello che però si sa è che non c’è una sovrapposizione completa tra GIST “SDH-deficient” e GIST che iperesprimono IGF1R. Nel caso l’espressione di SDH-B risulti conservata, il patologo può anche valutare l’espressione di IGF1R, sempre per immunoistochimica. L’identificazione dei GIST “SDH-deficient” è importante almeno per tre motivi: per la scelta della terapia più appropriata (inibitori delle tirosinchinasi di seconda e terza generazione, inibitori di IGF1R, modulatori epigenetici), per effettuare il counselling genetico e per attuare un follow up adeguato in vista del fatto che questi pazienti possono sviluppare nel corso della loro vita altri tumori (altri GIST indipendenti, paragangliomi, tumori renali ed adenomi ipofisari). Volevo aprire una parentesi sui GIST “SDH-deficient”, sottolineando che non sempre la mutazione di KIT e il difetto di SDH sono mutualmente esclusivi. Infatti abbiamo descritto un caso di una paziente con una sindrome di Carney-Stratakis (GIST e paraganglioma), che aveva una mutazione germline di SDHD ed una mutazione somatica attivante di KIT e che ha avuto una chiara risposta metabolica al trattamento con Imatinib. Questo caso suggerisce di non considerare aprioristicamente i GIST “SDH-deficient” resistenti ad imatinib e di indagare la presenza di mutazioni di KIT Imatinib sensibili anche nei casi conclamati di sindrome di Carney-Stratakis. Ritornando all’approccio del patologo ai casi non mutati per KIT e PDGFRA, una volta indagata la possibilità di un GIST “SDH-deficient”, è necessario escludere la possibilità di un GIST BRAF-mutato. I GIST BRAF-mutati riportati in letteratura ad oggi sono 28, sono quindi molti rari, rappresentando probabilmente meno dell’1% di tutti i GIST. Non differiscono clinicamente né istologicamente da quelli KIT/PDGFRA-mutati, tranne che per la loro tendenza a localizzarsi nel piccolo intestino. Se non è chiaro il valore prognostico della mutazione di BRAF, è invece riconosciuto il suo valore predittivo. Da una parte la mutazione di BRAF rende il trattamento con Imatinib inefficace e rappresenta un meccanismo di resistenza primitiva e secondaria, ma dall’altra parte sensibilizza il GIST al trattamento con gli inibitori di BRAF ed è stato riportato in letteratura un caso trattato con Dabrafenib che ha risposto sebbene temporaneamente. La mutazione può essere identificata con indagini molecolari, ma il patologo ha ora anche l’arma dell’anticorpo BRAF mutazione-specifico, che abbiamo testato su un’ampia serie di GIST. Il nostro studio suggerisce che la presenza di un’intensità di colorazione moderata/forte è predittiva della presenza della mutazione, mentre in caso di un’intensità di colorazione lieve è necessaria l’analisi mutazionale. Una volta indagata ed esclusa la presenza della mutazione di BRAF rimangono un sottogruppo di GIST, valutabili intorno all’8-10%, orfani da un punto di vista eziopatogenetico, indicati oggi come GIST “quadruplo-negativi”. In collaborazione con l’oncologia sperimentale del CRO di Aviano (Dott.ssa Roberta Maestro), abbiamo recentemente condotto uno studio di RNA-sequencing su 5 casi quadruplo-negativi (4 del piccolo intestino e 1 del retto) ed abbiamo identificato il trascritto di fusione ETV6-NTRK3 in 1 dei 5 casi, quello retale, confermato poi con Sanger e con FISH per ETV6. Era un GIST epitelioide ad alto rischio del retto di un uomo di 44 anni, che sta bene a 50 mesi dall’asportazione della neoplasia in assenza di trattamento. Abbiamo cercato il riarrangiamento di ETV6 in altri 26 casi di GIST arricchiti per casi rettali e casi quadruplo-negativi, ma non ne abbiamo trovato nessun altro.
Tuttavia al CTOS meeting dello scorso anno, un altro gruppo americano ha riportato un altro caso di GIST con la stessa traslocazione. ETV6-NTRK3 è stato originariamente descritto nel fibrosarcoma infantile come fusione tra esone 5 di ETV6 ed esone 15 di NTRK3. Il trascritto identificato nel caso di GIST è lievemente diverso: esone 4 di ETV6-esone 14 di NTRK3. E’ noto che il trascritto del fibrosarcoma infantile leghi IRS1 che è un substrato della pathway di IGF1R. Noi abbiamo dimostrato che anche il trascritto identificato nel GIST lega IRS1 e induce l’attivazione della pathway di IGF1R e sensibilizza le cellule transfettate con ETV6-NTRK3 agli inibitori di IGF1R e agli inibitori di ALK. Tra l’altro è in corso un trial con un farmaco inibitore di NTRK su un gruppo di pazienti con tumori di diverse istologie ma tutti con questa traslocazione, tra cui anche un paziente con GIST.
Ringrazio il mio primario, il prof. A.P. Dei Tos con il suo team dell’Ospedale Regionale di Treviso (L. Toffolatti, M. Campodellorto, M. Sbaraglia) e la dott.ssa R. Maestro del CRO di Aviano con il suo team (D. Gasparotto, M. Brenca, M. Polano).